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#Farbe und das Fluoreszenzmikroskop – Die kleinen Dinge

Farbe und das Fluoreszenzmikroskop – Die kleinen Dinge

In der Forschung bringt ein vergrößertes Bild einer Zelle die Wissenschaftler nicht wirklich weiter, jedenfalls in den meisten Fällen. Das grundsätzliche Aussehen von Zellen ist bekannt, man möchte vielmehr genauer verstehen wie die Prozesse in einer Zelle ablaufen. Dafür muss man sich anschauen was die verschiedenen Eiweiße in einer Zelle genau tun und wo sie sich befinden. Leider kann man nicht einfach dabei zusehen und so etwas über alle Eiweiße gleichzeitig lernen, Eiweiße sind viel zu klein um sie zu sehen oder bilden Strukturen mit so geringem Kontrast das auch die Phasenkontrastmikroskopie nicht weiterhelfen kann. Und genau dafür gibt es Farbstoffe, über die ich in Das bringt Farbe ins Leben schon ein wenig geschrieben habe.

Das Problem mit der Farb-Kamera

Ich glaube das überraschenste an einem Fluoreszenzmikroskop ist die Verwendung einer schwarz-weiß Kamera. Dieses Mikroskop, dass so wundervolle, farbenfrohe Bilder liefert, ist eigentlich farbenblind. Damit man verstehen kann warum gerade das extrem wichtig ist, müssen wir uns kurz mit Farben auseinander setzen. Hierbei geht es dann allerdings nicht um die Farbwahrnehmung des Menschen, die ohne Frage auch spannend ist, sondern um die Technik in digitalen Kameras.

Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von SH-SY5Y Zellen, in blau der Zellkern, in grün Clathrin-bedeckte Vesikel und in rot Mikrotubuli.

Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von SH-SY5Y Zellen, in blau der Zellkern, in grün Clathrin-bedeckte Vesikel und in rot Mikrotubuli. Anklicken für große Version (1776×1760 Pixel). (Bild: CC-BY 4.0 André Lampe)

Damit eine Digitalkamera Farben detektieren kann, besitzt sie verschiedene Detektoren, meistens für rotes, grünes und blaues Licht. Die Mischung dieser Farben sorgt dann später wieder dafür, dass wir am Bildschirm den Eindruck von vielen Millionen Farben haben, und um Fotos zu machen ist das auch vollkommen ausreichend. In der Mikroskopie möchte man aber nicht nur schöne Bilder machen sondern auch nachprüfbare Aussagen treffen, zum Beispiel wie unter diesen oder jenen Umständen das Eiweiß A im Verhältnis zu Eiweiß B in der Zelle vorkommt.

Markiere ich jetzt Eiweiß A mit einem roten Farbstoff und Eiweiß B mit einem grünen Farbstoff, hätte ich bei einer Farb-Kamera trotzdem ein Problem. Die Farbstoffe sind nämlich nicht rot oder grün sondern decken einen bestimmten Bereich des sichtbaren Spektrums ab. Das kann man hervorragend bei dem Graphen sehen, den ich schon im Artikel Das bringt Farbe ins Leben benutzt habe.

spektrum...

Spektrum eines Farbstoffs der in grün (568 nm) angeregt werden kann. Grüner Bereich: Wellenlängen die anregen können, oranger Bereich: Wellenlängen die ausgesendet werden können. Der grüne Strich zeigt eine Anregung durch einen Laser mit einer ganz bestimmten Wellenlänge. In rot ist der Filter dargestellt, der das Anregungslicht blockt, aber das meiste Fluoreszenzlicht durch lässt. Erstellt mit Semrock Searchlight.

Am unteren Rand des Graphen, an der x-Achse sieht man einen Regenbogen, der darstellen soll welche Farbe welcher Wellenlänge des Spektrums entspricht. Man sieht das der Farbstoff Alexa Fluor 568 schon im gelb-grünen Bereich Photonen aussenden kann, und das sein Emissionsspektrum sich weit bis in den roten Bereich hinein zieht. Würde man die Sensitivitäts-Kurven einer digitalen Farbkamera hier einzeichnen, würden sich die Bereich für grün und rot dieser Kamera überlappen, und zwar an der Stelle, bei der der Farbstoff Alexa Fluor 568 von oben, schon sehr viele Photonen abgibt, nämlich bei 588nm. Das heißt also, dass eine Farb-Kamera diesen roten Farbstoff als eine Mischung aus rot und grün detektieren würde. Man könnte jetzt meinen, dass man das Problem umgehen kann, wenn man einen roten Farbstoff und einen blauen Farbstoff benutzt, aber auch da muss ich leider enttäuschen. Sowohl ein blauer Farbstoff als auch ein roter Farbstoff würden auf einer Farb-Kamera Grünanteile aufweisen.

Wie macht man aus schwarz-weiß Farbe?

Die enttäuschende Antwort: überhaupt nicht. Bei einem Fluoreszenzmikroskop macht man für jede Farbe ein einzelnes Bild. Das geht auch kaum* anders, schließlich muss man einen Farbstoff mit einer definierten Wellenlänge anregen, sonst sendet er kein Fluoreszenzlicht aus. Dieses Fluoreszenzlicht ist gegenüber dem Anregungslicht etwas rot-verschoben, wie man oben in dem Graphen sehen kann. Vor der schwarz-weiß Kamera sitzt dann ein optischer Filter, der eben nur dieses Fluoreszenzlicht auf die Kamera fallen lässt. Und da sowohl Kamera als auch Mikroskop von einem Computer gesteuert werden, sagt die Software beim speichern des Bildes, dass dieses eine Bild die Farbe XY hat. Wenn man mag kann man dieses Bild rot sein lassen, damit es zur wirklichen Farbe des Farbstoffs passt, aber das ist kein muss. In einigen Fällen ist es sogar sehr sinnvoll von den eigentlichen Farben der Farbstoffe abzuweichen. Einige meiner Kollegen sind rot-grün-Farbenblind, und die freuen sich immer besonders, wenn ich ein Mikroskopiebild zeige, auf dem die interessanten Strukturen in rot und grün dargestellt sind. Mittlerweile haben das auch einige wissenschaftliche Journale erkannt, und schreiben vor, dass man zum Beispiel magenta-grün Darstellungen wählen soll. Ich habe das mal beispielsweise für das Mirksokopiebild von oben gemacht.

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